Izolace buněčných jader z listů Arabidopsis thaliana

Z Wikiknih
Skočit na navigaci Skočit na vyhledávání

Izolace buněčných jader z listů Arabidopsis thaliana - jedná se o standardní metodu ke získání DNA a jiných jaderných komponentů. Tento proces se skládá z několika kroků, jejichž optimalizací lze dosáhnout standardního výtěžku požadované jaderné složky. Jednotlivými kroky jsou homogenizace, odstranění nejaderných balastů, promytí a lýza jader.

1. Homogenizace a lýza buněčné stěny[editovat]

Cílem tohoto procesu je rozdrcení rostlinné tkáně a rozbití vyšších rostlinných struktur, aby došlo k uvolnění jednotlivých buněk. Zároveň musí být tento proces šetrný, aby nepoškodil samotné buňky. Metod homogenizace je několik např.:

  1. mechanická,
  2. enzymatická,
  3. osmotická.

U rostlinných tkání se nejvíce osvědčila homogenizace mechanická. Za pomocí tekutého dusíku jsou listy zmraženy a za přilévání dusíku do třecí misky drceny. Nejúčinnější homogenizace je ve chvíli, kdy se dusík odpaří, ale je třeba dbát na to, aby nedošlo k zahřátí vzorku, proto bez dusíku třeme co nejkratší chvíli a znovu dusíkem zchladíme. Dusík přiléváme opatrně, aby nedošlo ke ztrátě vzorku. Snažíme se třít co největší silou, pro co nejlepší výtěžek jader. Po dostatečné homogenizaci přeneseme vzorek (nejčastěji vychlazenou plastovou lžičkou) do lyzačního roztoku. Jedná se o roztok, který rozbije buněčné stěny a uvolní buněčné komponenty vč. Jader do roztoku. Lyzačních roztoky jsou různé, většinou obsahují sůl (NaCl, KCl), kyselinu (EDTA), sacharózu, dále se liší dle použitého protokolu.[1] [2]

2. Odstranění balastů[editovat]

Po lýze buněk dostáváme roztok obsahující směs veškerých proteinů a složek tkáně listů. Je třeba odstranit co nejvíce těch složek při zachování jader. Složení promývacích roztoků se liší podle použitého protokolu, obsahují však vždy detergent solubilizující membránové proteiny (Triton X-100[3], Tween, aj.). Při promývání můžeme již pouhým okem vidět, jak vzorek bělá – odstraňuje se chlorofyl a cytosolické složky a vzniká nám bílý pelet, obsahující hlavně jádra ale stále i další proteiny. Velmi výhodným krokem je použití Percollového pufru. Percoll způsobuje flotaci jader, proto po centrifugaci nacházíme jádra na hladině a ostatní balasty na dně zkumavky. Jádra opatrně sebereme do další zkumavky.[4]

3. Promytí jader[editovat]

Jádra je nutné promýt, pro odstranění detergentů, které by při další analýze interferovaly nebo pro odstranění Percollu z téhož důvodu. Promytí probíhá opět pomocí roztoků, které se mohou lišit pouze tím, že neobsahují detergent, použitý při odstranění balastů. Po promytí jader bychom měli získat pelet čistých jader připravených k dalšímu zpracování nebo zamražení pro použití později. Pokud zamrazujeme je třeba jádra resuspendovat v promývacím purfu a smísit 1:1 s glycerolem, dobře promísit a ihned zmrazit v tekutém dusíku a následně uchovat při -80 °C. [5]

4. Lýza jader[editovat]

Čerstvá nebo rozmražená jádra po odstranění glycerolu je nutné lyzovat, jinak bychom se přes jadernou membránu nepropracovali k námi požadovaným proteinům. Lýza jaderné membrány by měla být co nejšetrnější, abychom nepoškodili proteiny. Po lýze dostáváme směs jaderných proteinů a fragmentů jaderné membrány. Následují specifické postupy extrakce, závisející na druhu proteinů, které chceme získat, př. Rotace peletu resuspendovaném v 0,2M H2SO4 po dobu 16 h pro extrakci jaderných histonů.

5. Roztoky[editovat]

Lýza buněčné stěny: Pufr A
10mM MES pH 6.0
5mM EDTA
10mM NaCL
250mM sacharóza
0,6% Triton X-100
150 uM spermidin
100 uM PMSF
20 mM merkaptoetanol
Lýza buněčné stěny: Lysis Buffer (LB)
20 mM Tris-HCl, pH 7.4 2 ml (1 M)
25% Glycerol 25 ml
20 mM KCl 1 ml (2M)
2 mM EDTA 0.4 ml (0.5M)
2.5 mM MgCl2 0.25 ml (1M)
250 mM Sucrose 12.5 ml (2M)
Add H2O to 100ml
Add DTT and PMSF to a final concentration of 1mM respectively, immediately before use
Odstranění balastů: Pufr B
2,4 g pufru 5xA
18g Percoll
Těsně před použitím se přidá:
14,2 ul merkaptoetanolu
40ul 0,1M PMSF
Odstranění balastů: Nuclei Resuspension Buffer with 0.2%Tition-X100 (NRBT)
20 mMTris-HCl, pH 7.4 2 ml (1M)
25% Glycerol 25 ml
2.5 mM MgCl2 0.25 ml (1M)
0.2% Triton X-100 0.2 ml
Add H2O to 100ml
Promytí jader: Pufr C
10mM Tris-Cl pH 7,7
100mM síran amonný
10mM MgCl2
5mM merkaptoetanol
Promytí jader: Nuclei Resuspension Buffer (NRB)
20 mMTris-HCl, pH 7.4 2 ml (1M)
25% Glycerol 25 ml
2.5 mM MgCl2 0.25 ml (1M)
Add H2O to 100ml
Lýza jader: Lyzační pufr
100 mM NaCl
3 mM EDTA
50 mM Tris-Cl, pH = 8
1 % CHAPS
Inhibitory proteáz
Lýza jader: Lyzační pufr s močovinou
8 M urea
150 mM NaCl
50 mM Tris-Cl, pH = 7,5
5 mM DTT

Zdroje[editovat]

  1. Protein Analysis/Proteomics. In: Protein Analysis/Proteomics [online]. 2006 [cit. 2014-05-22].
  2. BERGMÜLLER, Eveline, Peter M. GEHRIG a Wilhelm GRUISSEM. Characterization of Post-Translational Modifications of Histone H2B-Variants Isolated from Arabidopsis thaliana. Journal of Proteome Research [online]. 2007, vol. 6, issue 9, s. 3655-3668 [cit. 2014-05-22]. DOI: 10.1021/pr0702159. Dostupné z: http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/pr0702159
  3. Triton X-100. In: Wikipedia: the free encyclopedia [online]. San Francisco (CA): Wikimedia Foundation, 2001- [cit. 2014-05-22]. Dostupné z: http://en.wikipedia.org/wiki/Triton_X-100
  4. CLP – ANALYSIS OF MOLECULAR MARKERS: DNA ISOLATION, RAPD, AFLP, PCR-RFLP – CZECH VERSION. In: CLP – ANALYSIS OF MOLECULAR MARKERS [online]. 2007 [cit. 2014-05-22].
  5. Izolace buněčných jader z rostlinných tkání. In: Izolace buněčných jader z rostlinných tkání [online]. 2008 [cit. 2014-05-22].