Laboratorní technika/Papírová chromatografie

Papírová chromatografie je dříve často užívaná, experimentálně jednoduchá, chromatografická technika, v planárním (plošném) uspořádání. Jedná se o rozdělovací chromatografii, kdy o pohyblivosti jednotlivých složek dělené směsi rozhoduje rozdělovací koeficient dělených látek mezi vodu vázanou na papír a mobilní fázi. Uspořádání papírové chromatografie může být vzestupné, sestupné nebo i horizontální. Dělící schopnost je zde ve srovnání s modernějšími metodami nižší.

Princip papírové chromatografie

Stacionární fáze je kapalná a při separaci se uplatňuje rozdílná rozpustnost složek analytu v stacionární fázi a v mobilní fázi. Stacionární fází je nejčastěji voda naabsorbovaná na nosič z atmosféry ve vyvíjecím tanku.

Mobilní fáze je kapalná, omezeně mísitelná až nemísitelná se stacionární fázi. Je to buď čistá látka, nebo směs látek různé polarity.

Nosičem stacionární fáze je čistá celulóza ve formě papíru.

Instrumentace

Chromatografický papír

je vyrobený z celulózy vysoké čistoty. Má přesně definovanou tloušťku, přesně definovanou pórovitost,  přesně definované uspořádání vláken, má předepsaný směr toku mobilní fáze  (komerčně dodávaný arch chromatografického papíru má obdélníkový tvar a mobilní fáze musí proudit ve směru delší strany). Nejznámější značka je Whattman.

Nanášení analytů nebo standardů na chromatografický papír se provádí pomocí kapiláry nebo mikropipety. Kapilárou se nanáší pro kvalitativní analýzu, mikropipety se používá pro  kvantitativní analýzu.

Obdélníkový tvar archu chromatografického papíru

Nanášení analytu kapilárou

Nanášení standardu kapilárou

Analyt nebo standard se nanáší na chromatografický papír tak, aby poloměr skvrny nepřesáhl pět milimetrů. Analyt se nanáší doprostřed mezi standardy.

Vyvíjecí zařízení

Vyvíjení se provádí v uzavřeném prostoru (vyvíjecí tank nebo jiná vhodná uzavíratelná nádoba). Důvodem je zamezení odpařování mobilní fáze a nasycení nosiče stacionární fázi

Stojan a vyvíjecí vanička

Tank se stojanem a vaničkou

Techniky vyvíjení

Sestupná technika

mobilní fáze se pohybuje seshora dolů. Chromatogram s nanesenými analyty se vloží do prázdné vyvíjecí vaničky, na dno tanku se nalije malé množství mobilní fáze a tank se na dobu asi pět minut uzavře, aby došlo k nasycení chromatogramu vodními párami.

Pak se do vaničky opatrně nalije mobilní fáze, tank se uzavře a sleduje se postup vyvíjení.

Chromatogram ve vyvíjecí vaničce	Chromatogram v tanku - začátek vyvíjení
Stav vyvíjení chromatogramu po 28 minutách	Stav vyvíjení chromatogramu po 96 minutách

Sestupné vyvíjení může proběhnout

Bez přetečení mobilní fáze,

což znamená, že obsluha zastaví pohyb mobilní fáze chromatogramem dříve, než její čelo dosáhne konce chromatografického papíru

S přetečením mobilní fáze

mobilní fáze protéká přes celou délku chromatogramu a odkapává na dno vyvíjecího tanku. V takovém případu je vhodné opatřit dolní konec chromatogramu zoubkováním. pro zajištění rovnoměrného toku

Vzestupná technika

mobilní fáze se pohybuje zdola nahoru. Nevýhodou je snižování rychlosti pohybu mobilní fáze.

Vyvíjecí nadoby a chromatogramy s nanesenými analyty	Chromatogramy připravené k vyvíjení - sycení vodními párami	Zahájení vyvíjení
Stav vyvíjení po 10 minutách	Stav vyvíjení po 40 minutách	Vyvolané chromatogramy

Technika opakovaného vyvíjení

používá několik mobilních fázi. Provede se chromatografie s první mobilní fázi a chromatogram se vysuší.

Provede se chromatografie s druhou mobilní fázi a chromatograf se opět vysuší

A tak dále podle počtu mobilních fází.

Technika dvourozměrného vyvíjení

Papír je čtvercového tvaru. Provede se chromatografie v jednom směru, první mobilní fází.

Chromatogram se vysuší a pak se provede chromatografie ve druhém směru, kolmém na první, s druhou mobilní fázi

Kruhová technika

Mobilní fáze se přivádí do středu chromatogramu, odkud se pohybuje horizontálně.

Kruhová chromatografie

Vyhodnocení chromatogramu

Kvalitativní vyhodnocení

Kvalitativním ukazatelem je poloha skvrny anylytu anebo standardu na chromatogramu, vyjádřená retenčním faktorem.

Retenční faktor

Retenční (retardační) faktor R_F je při použití vyvíjení bez přetečení dán poměrem vzdálenosti středu skvrny a od startu ku vzdálenosti čela mobilní fáze m.

Vyhodnocení sestupného chromatogramu

Numerické vyhodnocení sestupného chromatogramu

Vyhodnocení vzestupných chromatogramů

Závěr ukázkové chromatografické analýzy:

• vzorek obsahuje dvě složky, protože se vytvořily dvě skvrny
• první skvrna má R_F faktor a barvu podobnou jako má standard methyloranž
• druhá skvrna má R_F faktor a barvu podobnou jako má standard bromthymolová modř
• vzorek s velkou pravděpodobností obsahuje methyloranž a bromthymolovou modř

Při použití vyvíjení s přetečením je retenční (retardační) faktor R_F dán poměrem vzdálenosti středu skvrny a analytu od startu, ku vzdálenosti středu skvrny b některého standardu od startu.

Kvantitativní vyhodnocení

Kvantitativním ukazatelem je plocha nebo intenzita zabarvení skvrny analytu na chromatogramu. Tyto hodnoty se vždy srovnávají s plochou nebo intenzitou zabarvení skvrny, kterou vytvořilo známé množství standardů za stejných podmínek chromatografie. Měření intenzity zabarvení skvrny se provádí spektrofotometricky.

Odkazy

Externí odkazy

• Encyklopedický článek Papírová chromatografie ve Wikipedii